O que é western blot?

Western Blot: Uma Visão Geral

O Western Blot, também conhecido como imunoblot, é uma técnica analítica amplamente utilizada em biologia molecular para detectar proteínas específicas em uma amostra. Essa técnica combina a resolução de proteínas por tamanho através de <a href="https://pt.wikiwhat.page/kavramlar/eletroforese%20em%20gel">eletroforese em gel</a> com a capacidade de detectar uma proteína alvo específica utilizando anticorpos.

Etapas Principais do Western Blot:

1. Preparo da Amostra: A amostra contendo as proteínas de interesse é preparada. Isso pode envolver a lise celular ou tecidual para liberar as proteínas. Um importante passo é adicionar desnaturantes (como SDS) e agentes redutores (como DTT ou β-mercaptoetanol) para linearizar as proteínas e quebrar ligações dissulfeto, garantindo que migrem apenas pelo seu tamanho.

2. Eletroforese em Gel: As proteínas são separadas por tamanho usando <a href="https://pt.wikiwhat.page/kavramlar/eletroforese%20em%20gel%20de%20poliacrilamida%20SDS">(SDS-PAGE)</a>. O SDS confere uma carga negativa uniforme às proteínas, permitindo que a separação ocorra com base no seu peso molecular.

3. Transferência (Blotting): As proteínas separadas no gel são transferidas para uma membrana, tipicamente de nitrocelulose ou PVDF (difluoreto de polivinilideno). A transferência é geralmente realizada usando corrente elétrica (eletrotransferência) ou, menos comum, por difusão capilar.

4. Bloqueio: A membrana é bloqueada para evitar a ligação não específica dos anticorpos. Isso é feito incubando a membrana em uma solução contendo proteínas como leite desnatado seco ou BSA (albumina de soro bovino).

5. Incubação com Anticorpo Primário: A membrana é incubada com um anticorpo primário específico para a proteína de interesse. Esse anticorpo se liga à proteína alvo na membrana.

6. Lavagem: A membrana é lavada para remover o anticorpo primário não ligado.

7. Incubação com Anticorpo Secundário: A membrana é incubada com um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário. O anticorpo secundário é conjugado a uma enzima (como peroxidase do rábano-forte - HRP) ou a um fluorocromo.

8. Lavagem: A membrana é lavada novamente para remover o anticorpo secundário não ligado.

9. Detecção: A proteína alvo é detectada através da reação da enzima conjugada ao anticorpo secundário com um substrato. A reação produz um sinal que pode ser detectado por quimiluminescência (emissão de luz), fluorescência ou colorimetria. A escolha do método de detecção depende da sensibilidade desejada e do equipamento disponível.

10. Análise: A intensidade das bandas correspondentes à proteína alvo é medida e pode ser quantificada para comparar os níveis de expressão da proteína entre diferentes amostras. A <a href="https://pt.wikiwhat.page/kavramlar/quantificação%20de%20western%20blot">quantificação de Western blot</a> é frequentemente realizada por densitometria.

Aplicações do Western Blot:

• Confirmação da expressão de proteínas.
• Determinação do tamanho de uma proteína.
• Detecção de modificações pós-traducionais (fosforilação, glicosilação, etc.).
• Comparação dos níveis de expressão de proteínas entre diferentes amostras ou condições experimentais.
• Diagnóstico de doenças (ex: detecção de proteínas anormais).

Controles Importantes:

• Controles Positivos: Amostras conhecidas por conter a proteína alvo.
• Controles Negativos: Amostras conhecidas por não conter a proteína alvo.
• Controles de Carregamento (Loading Controls): Proteínas expressas constitutivamente em todas as amostras (ex: β-actina, GAPDH) para normalizar os dados e corrigir variações no carregamento da amostra.

Limitações:

• Pode ser afetado pela qualidade dos anticorpos.
• Pode ser demorado e trabalhoso.
• A quantificação pode ser afetada por fatores como saturação da banda e variações na transferência.
• Não fornece informações sobre a localização subcelular da proteína.